Povestea PacBio începe la Cornell University, unde Jonas Korlach și Stephen Turner au pornit de la o întrebare ambițioasă: cum ar putea fi observată, în timp real, activitatea unei singure molecule de ADN polimerază, enzima care copiază ADN-ul?
Din această idee s-a născut tehnologia zero-mode waveguide, sau ZM, un godeu microscopic atât de mic încât lumina este limitată la un volum extrem de redus, de ordinul zeptolitrilor (10 la puterea -21). În acest spațiu minuscul, sistemul poate urmări activitatea unei singure molecule de ADN polimerază, fără ca restul moleculelor fluorescente din soluție să fie luminate și să producă un semnal de fundal puternic.
Acesta este principiul tehnologiei PacBio SMRT, adică Single Molecule, Real-Time sequencing: secvențiere în timp real, la nivel de moleculă unică. În timpul secvențierii, polimeraza copiază ADN-ul adăugând nucleotidele A, C, G și T. Fiecare nucleotidă are un semnal fluorescent diferit, iar sistemul transformă succesiunea impulsurilor luminoase într-o secvență genetică.
Un aspect foarte interesant al tehnologiei PacBio este că, în timp ce citește secvența ADN, sistemul observă și felul în care polimeraza lucrează. Aceasta se numește cinetica polimerazei: ritmul cu care enzima adaugă nucleotidele, cât durează fiecare semnal luminos și cât timp trece între două incorporări succesive. Acest detaliu este important deoarece ADN-ul nu conține doar informația scrisă în literele A, C, G și T. Pe ADN pot exista și grupări metil atașate, care nu schimbă nucleotidele, dar pot influența modul în care genele sunt reglate. Metilarea este o formă de informație epigenetică: nu modifică secvența ADN, dar poate afecta felul în care aceasta este citită și folosită de celulă.
Din această combinație de biologie, optică și nanofabricare s-a născut Pacific Biosciences, cunoscută astăzi ca PacBio. Tehnologia PacBio permite citirea unor fragmente lungi de ADN, de obicei în intervalul 10-25 kilobase sau mai mult, în funcție de probă și aplicație. Aceste citiri lungi sunt ca niște piese mari de puzzle: ajută la reconstruirea mai corectă a genomului și la analizarea regiunilor repetitive, complexe sau greu accesibile prin metodele short-read.
Un avantaj important este că PacBio HiFi combină lungimea citirilor cu o acuratețe foarte ridicată. Fragmentele de ADN sunt transformate în molecule SMRTbell, care permit polimerazei să citească aceeași moleculă de mai multe ori. Din aceste citiri repetate, software-ul incorporate în instrument construiește o secvență consens foarte precisă, numită HiFi read.
La scara mea de acțiune, de când lucrez la PacBio, am avut ocazia să întâlnesc cercetători din toată Europa și să văd cât de multiple sunt aplicațiile acestei tehnologii. În genomica umană, secvențierea HiFi poate ajuta la elucidarea unor regiuni greu accesibile ale genomului, la înțelegerea bolilor rare și a cazurilor genetice complexe, precum și la identificarea unor tipuri de variație genetică ce pot rămâne invizibile prin metode mai limitate.
Dar PacBio nu este doar o tehnologie pentru genomul uman. Este o platformă de descoperire pentru toate științele vieții. Poate fi folosită pentru a studia microorganismele care trăiesc în intestinul unei musculițe mediteraneene, bacteriofagii (virușii care infectează bacterii) din microbiomul uman, microorganismele de pe fundul lacurilor sau din zone cu ape reziduale, microorganisme din sol, dar și genomuri de plante precum trandafirul, exponate din muzee de știință naturală sau chiar ecosisteme intregi.
Pentru mine, aceasta este una dintre cele mai frumoase dimensiuni ale tehnologiei PacBio: capacitatea de a face vizibil ceea ce înainte era greu sau imposibil de citit. Fie că vorbim despre genomul unui pacient cu o boală genetică rară, despre un microorganism necunoscut dintr-un ecosistem îndepărtat sau despre diversitatea genetică a unei specii importante pentru agricultură, secvențierea long-read de înaltă acuratețe ne ajută să vedem cu mai multă claritate arhitectura ascunsă a vieții.
- Vezi mai multe articole ale autoarei – AICI
