Vlad Țepeș lăcrima sânge – noile descoperiri ale cercetătorilor străini

Vlad Țepeș este o figură importantă atât în istoria României cât și pe plan internațional, fiind prezent în istorie drept domnitorul ale cărui pedepse forțau limitele cruzimii cât și în literatură ca inspirație a personajului Dracula de Bram Stoker.

O echipă internațională de cercetători a publicat recent un studiu care detaliază analiza a trei scrisori despre care se știe că au fost scrise de Vlad Țepeș.

Deși nu erau deosebit de captivante,  în mare parte despre lucruri birocratice obișnuite, cum ar fi colectarea taxelor, aceste scrisori dețineau în ele o mulțime de date despre faimosul domnitor. Cercetarea a fost publicată pe 8 August în revista Analytical Chemistry, citat de American Chemical Society.

Prima scrisoare (numărul catalogului arhivei este II 365), din 4 august 1475, aici cercetată, arătând și pozițiile benzilor de EVA (dreptunghiuri brune) aplicate pe suprafața acesteia pentru captarea materialului biologic; (b) cartografierea fluorescenței fenilalaninei, tirozinei și triptofanului sub iluminare UV flash.

Scrisoare din 1475 arată semnătura lui Vlad Țepeș în partea stângă jos. Peticele maro sunt peliculele EVA aplicate pentru captarea materialului biologic. A doua imagine arată maparea fluorescenței sub iluminare UV flash

A treia scrisoare (datată 1457; numărul de catalog arhivă: V 1658) , aici investigată după restaurare și prelevarea regiunilor cu dischete EVA (cele patru materiale de tip petic maro/bandă); (b) cartografierea fluorescenței fenilalaninei, tirozinei și triptofanului sub iluminare UV flash.

Eșantionarea proteinelor prin dischete EVA

Prelevarea de proteine ​​prin dischetele EVA a fost efectuată la arhiva guvernului de la Sibiu, România, în condiții de curațenie, cu mănuși de nitril, pensete, huse curate și sterile și suprafețe de sprijin. Pentru prelevarea din scrisorile cu suprafață mare, este necesara găsirea locurilor cu o concentrație mai mare de proteine.

Pentru această navigație, a fost utilizată fluorescența fenilalaninei, tirozinei și triptofanului sub iluminare UV. În special, au fost folosite leduri UV pentru iluminare și o cameră digitală pe un smartphone cu un filtru optic special pentru detectarea fluorescenței.

Software-ul special pentru interfața de realitate augmentată a fost folosit pentru indicarea rapidă a locurilor cu concentrații mari de proteine. Nivelul de fluorescență în fiecare punct a fost afișat în pseudo-culori pe interfața instrumentului (verde, galben și roșu, în ordinea creșterii intensității fluorescenței). Acest lucru a făcut posibilă identificarea rapidă a regiunilor pentru eșantionare pe suprafețele scrisorilor lui Vlad Țepeș.

Acest sistem mobil și software-ul au fost realizate în SpringStyle Tech Design Ltd pentru examinarea rapidă a prezenței urmelor de proteine ​​pe mostrele de patrimoniu arheologic și cultural. Pentru a recolta proteine, dischetele EVA au fost umidificate ușor cu apă ultrapură și apoi plasate pe litere în diferite regiuni timp de 60 de minute (a se vedea figurile 1a, 2a și 3a).

În cele din urmă, pentru a preveni uscarea foliilor EVA, acestea au fost acoperite cu parafilm din exterior. O scrisoare modernă scrisă și atinsă de autori a fost folosită ca eșantion de referință. Eșantionarea proteinelor pe dischete EVA din scrisoarea de referință modernă și caracterizarea proteomică au fost efectuate în același mod ca cel al literelor antice (vezi Informațiile justificative).

Nivelul de deamidare (raportat ca procent) al reziduurilor de asparagină (N) și glutamină (Q) în „Uman” (a), „Bacterii” (b), „Viruși” (c), „ciuperci” (d), „Insecte” ” (e) și peptide „Viridiplantae” (f). Este raportat și nivelul de deamidare al peptidelor contaminante identificate în fiecare căutare în baza de date. Barele de eroare indică abaterea standard calculată după 1000 de iterații bootstrap.

Ce spun cercetătorii despre descoperire?

• A fost efectuată o abordare bazată pe MS pentru a caracteriza proteinele capturate de dischetele EVA din trei scrisori scrise de Vlad Țepeș, voievod al Țării Românești în a doua jumătate a secolului al XV-lea. Calculul nivelului de deamidare și al altor DCM a permis deosebirea peptidelor endogene „originale” de cele contaminante. Abordarea adoptată aici a permis identificarea, ca potențiale componente endogene originale, a 16 proteine ​​care sunt cu siguranță de origine umană.
• Au fost identificate foarte puține diferențe între scrisoarea din 1457 și cele două documente datate 1475. După cum era de așteptat, multe dintre proteinele detectate sunt legate de piele, dar trei proteine ​​(adică, TRANK1, DNAH5 și DNAH11) implicate în sistemul respirator uman au fost identificate de asemenea.
• În special, două proteine ​​legate de respirație (DNAH5 și DNAH11) apar de interes deoarece mutațiile genelor care codifică aceste două proteine ​​sunt implicate cu unele ciliopatii ale tractului respirator și cu boli retiniene. Mai mult, au fost identificate cinci proteine ​​(TTN, DCD, AHNAK, KTN1 și DNAH5) provenite din sânge. În special, a fost detectată o proteină foarte exprimată în glandele sudoripare (adică dermcidin, DCD), care face parte și din proteomul lacrimii.
• În plus, ținând cont de nivelul foarte ridicat de degradare al proteinelor antice, datele proteomice au fost interpretate și la niveluri de peptide (adică, fără a lua în considerare doar proteinele identificate de cel puțin două peptide). În acest fel, am caracterizat aproximativ 500 de peptide, dintre care aproximativ 100 de peptide erau cu siguranță de origine umană. Dintre acest grup de peptide umane, 31 par a fi de interes. Multe dintre ele au fost depistate în documentele scrise în 1475, în timp ce 11 au fost găsite doar în scrisoarea din 1457.
• Peptide legate de proteinele din sânge sau provenite din proteine ​​implicate în sistemul respirator au fost identificate în toate documentele caracterizate. Mai mult, în toate cele trei scrisori, au fost depistate și unele peptide legate de proteine ​​implicate în ciliopatie sau boli retiniene, sau aparținând unor proteine ​​asociate proceselor inflamatorii. Dimpotrivă, trei peptide asociate cu proteine ​​ale retinei și lacrimi au fost detectate doar în documentele din 1475.
• Deși datele proteomice nu pot fi considerate exhaustive, în totalitate, aceste identificări ar putea indica faptul că Dracula „a plâns lacrimi de sânge”, adică suferea de starea de hemolacrie, așa cum relatează unele povești.
• Diferențele observate între scrisoarea din 1457 și cele două documente din 1475, și în special identificarea peptidelor proteinelor retinei și a lacrimilor doar în ultimele două litere, pot fi legate de calitatea mai bună a conservării acestor documente, așa cum este descris mai sus. Cu toate acestea, o stare de boală diferită a contelui Dracula nu poate fi exclusă între 1457 și 1475.
• Pe de altă parte, identificarea în toate cele trei documente a unor peptide provenite din proteine ​​legate de respirație și/sau implicate în unele ciliopatii ale tractului respirator, împreună cu peptide aparținând proteinelor asociate proceselor inflamatorii, ar putea oferi o imagine a stării generale de sănătate a contelui Dracula care probabil a suferit și de procese inflamatorii ale tractului respirator și/sau ale pielii.
• Este important de subliniat că nu putem nega că probabil mai multe persoane au atins aceste documente, dar este de asemenea de presupus că cea mai proeminentă amprentă proteică ar trebui să fie legată de Prințul Vlad Țepeș. În plus, o investigație metaproteomică a celor trei litere a permis identificarea și caracterizarea a mii de peptide provenind din bacterii, viruși, ciuperci, insecte și viridiplantae care pot ajuta la deschiderea unei ferestre, la nivel molecular, în viața secolului al XV-lea.
• Majoritatea peptidelor bacteriene provin din flora intestinală. În special, ele aparțin filumului Firmicutes, un grup de bacterii Gram pozitive, sau aparțin Enterobacterales, un grup mare de bacterii Gram negative, inclusiv o serie de agenți patogeni prezenți în tractul intestinal uman, care sunt o parte normală a intestinului. Flora, dar poate reprezenta, de asemenea, o cauză comună a infecțiilor intestinale, ale tractului urinar și, de asemenea, poate provoca infecții asociate îngrijirii sănătății.
• Este de remarcat faptul că, printre Enterobacterales, unele peptide sunt specifice Y. pestis, bacteria patogenă care provoacă ciuma, care a dus la moartea a aproximativ 25 de milioane de oameni în Europa între 1347 și 1352 și a fost nevoie de 150 de ani pentru ca populația Europei să ajungă depășiți de acest dezastru. Dintre peptidele provenite de la viruși, multe dintre ele provin de la viruși răspândiți în principal prin căpușe și țânțari și sunt legate atât de plante, cât și de viruși patogeni umani.
• În mod analog, investigarea peptidelor din ciuperci a relevat prezența dominantă a peptidelor specifice aparținând ciupercilor prezente în fructele supracoapte și, de asemenea, ciuperci patogene pentru oameni (de exemplu, C. glabrata și C. albicans) și plante.
• Posibila prezență a fructelor supracoapte în același mediu cu aceste litere poate fi confirmată de identificarea multor peptide care sunt specifice genului Drosophila (adică „muștele mici ale fructelor”), insecte care zăbovesc în jurul fructelor supracoapte sau putrezite. În fine, dintre proteinele și peptidele înrudite cu Viridiplantae, cele mai proeminente grupuri sunt specifice familiei Brassicaceae și ordinului Poales (în principal Oryza și Triticeae).

Ca rezultat al acestei analize, experții au concluzionat că Vlad Țepeș ar fi plâns cu lacrimi de sânge.

Concluzia cercetătorilor:

• Prin cuplarea tehnologiei EVA și a MS de înaltă rezoluție, a fost efectuată o explorare aprofundată a trei documente originale scrise de prințul român Vlad al III-lea, cunoscut și sub numele de Vlad Țepeș, sau Vlad Drăculea. Această abordare ne-a permis să caracterizăm aproximativ 100 de peptide antice de origine cu siguranță umană și mai mult sau mai puțin 2000 de peptide provenite din mediu (Bacterii, Viruși, Insecte, Ciuperci și Viridiplantae).
• În total, datele proteomice raportate aici, deși nu pot fi considerate exhaustive, ar putea indica faptul că, potrivit unor povești, probabil că ar fi suferit, cel puțin în ultimii ani ai vieții, de o afecțiune patologică numită hemolacrie, adică ar putea elimina lacrimi amestecate cu sânge. În plus, probabil a suferit și de procese inflamatorii ale tractului respirator și/sau ale pielii.
• În opinia noastră, aceasta este prima dată când se fac astfel de cercetări și au contribuit la evidențierea stării de sănătate a lui Vlad Dracula Țepeș. Nu se poate nega că mai mulți oameni medievali au atins aceste documente, dar este de asemenea de presupus că cele mai proeminente proteine ​​antice ar trebui să fie legate de prințul Vlad Țepeș, care a scris și a semnat aceste scrisori…
• În ansamblu, aceste rezultate au fost obținute, datorită performanței și sensibilității ridicate a MS de înaltă rezoluție cuplată cu tehnica EVA, o metodă de prelevare cunoscută pentru a nu contamina sau deteriora documentele investigate. În acest sens, se speră astfel că metodologia EVA ar putea fi aplicată și în alte câteva cazuri de relevanță istorică pentru a arunca mai multă lumină asupra documentelor importante din trecutul nostru. (sursa: Analytical Chemistry)